Puntos catiónicos de carbono reticulado

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2678 (2023) Citar este artículo

2141 Accesos

11 Altmetric

Detalles de métricas

La inmunidad de las mucosas juega un papel importante en la defensa de primera línea contra los virus transmitidos e infectados a través del sistema respiratorio, como el SARS-CoV-2. Sin embargo, la falta de adyuvantes efectivos y seguros actualmente limita el desarrollo de vacunas mucosas COVID-19. En el estudio actual, preparamos una vacuna intranasal que contiene puntos de carbono reticulados catiónicos (CCD) y un antígeno SARS-CoV-2, RBD-HR con partícula de antígeno espontánea. La inmunización intranasal con CCD/RBD-HR induce altos niveles de anticuerpos con neutralización de amplio espectro contra virus/pseudovirus auténticos de variantes incluidas en Omicron y protege a los ratones BALB/c hembra inmunizados de la infección por Omicron. A pesar de la fuerte estimulación de la respuesta inmunitaria celular sistémica, la vacuna intranasal CCD/RBD-HR también induce una potente inmunidad en las mucosas según lo determinado por la generación de células T residentes en los tejidos en los pulmones y las vías respiratorias. Además, CCD/RBD-HR no solo activa las células presentadoras de antígeno (APC) profesionales, las células dendríticas, sino que también se dirige de manera efectiva a las células epiteliales nasales, promueve la unión de antígenos a través del ácido siálico y, sorprendentemente, provoca la presentación de antígenos de las células epiteliales nasales. Demostramos que CCD es un adyuvante de vacuna intranasal prometedor para provocar una fuerte inmunidad de la mucosa y podría ser un adyuvante candidato para el desarrollo de vacunas intranasales para muchos tipos de enfermedades infecciosas, incluido COVID-19.

Desde diciembre de 2019, el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) se ha propagado rápidamente por todo el mundo y ha causado la pandemia1 de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). La variante de Omicron recientemente surgida se ha convertido en la cepa dominante a nivel mundial2, lo que ha comprometido gravemente la eficacia de las vacunas actualmente disponibles, ya que las mutaciones en el dominio de unión al receptor (RBD) confieren a estas variantes preocupantes (COV) la capacidad de escapar de los ataques inmunitarios2,3, 4. Por lo tanto, se necesitan vacunas de próxima generación que puedan brindar una protección fuerte y amplia5,6,7. Recientemente, nuestro grupo produjo y evaluó con éxito RBD-HR como antígeno del SARS-CoV-2, que aprovecha las propiedades de ensamblaje automático de las secuencias de repetición de heptada 1 (HR1) y HR2 en la proteína espiga del SARS-CoV-25. . La proteína RBD recombinante fusionada con HR que contiene mutaciones L452R y T478K se autoensambló con éxito en trímeros que mostraron una excelente inmunogenicidad e indujeron una potente respuesta inmunitaria contra la variante Omicron con adyuvante MF59 después de la inmunización intramuscular. Sin embargo, la ruta de inmunización tradicional es subóptima para inducir respuestas inmunitarias en las mucosas, que son esenciales para defenderse contra las enfermedades transmitidas por las mucosas, incluido el SARS-CoV-28,9.

Hasta la fecha se han realizado grandes esfuerzos para desarrollar vacunas intranasales contra la COVID-19, cuatro de las cuales han alcanzado la fase 3 de ensayos clínicos10. Las vacunas basadas en proteínas recombinantes se han estudiado ampliamente en el contexto de la administración intranasal11,12. Sin embargo, debido a la escasa inmunogenicidad, la adición de adyuvantes a las vacunas basadas en proteínas recombinantes es crucial para mejorar la persistencia, amplitud y fuerza de las respuestas inmunitarias13. Se han diseñado varios adyuvantes para vacunas intranasales, incluidos adyuvantes de toxoides (CTA1DD y LThaK), agonistas de receptores de reconocimiento de patrones (p. ej., Poly I:C, monofosforil lípido A (MPL) y c-di-AMP), citocinas, etc. 8. A pesar de la eficacia prometedora, estos adyuvantes no han sido aprobados para uso humano en gran parte debido a problemas de seguridad.

Los puntos de carbono (CD), descubiertos por primera vez en 2004, se han desarrollado rápidamente en el campo biomédico debido a su pequeño tamaño, química de superficie controlable, excelente dispersabilidad en agua, buena biocompatibilidad y menor impacto ambiental14,15. Debido a la carbonización incompleta, algunos grupos funcionales pueden permanecer en la estructura de los CD. Esto dotó a las CD de propiedades únicas a partir de precursores y permitió que se usaran ampliamente para administrar ADN/ARN para terapia génica16 y fármacos quimioterapéuticos17. El tamaño a escala nanométrica también ha inspirado la aplicación de CD para administrar el antígeno modelo ovoalbúmina (OVA) por vía intranasal14. Sin embargo, aún no se ha verificado la aplicación de CDs en vacunas intranasales en un estado de enfermedad real.

En este estudio, sintetizamos puntos de carbono reticulados (CCD) catiónicos utilizando un conector para conectar los CD a través de una simple reacción de apertura de anillo, que puede atraer antígenos RBD-HR con polipéptidos aniónicos y formar nanopartículas mediante interacciones electrostáticas. La vacunación intranasal con proteína recombinante RBD-HR con adyuvante de CCD produjo respuestas inmunitarias sólidas, ampliamente protectoras y a largo plazo contra la infección por SARS-CoV-2, incluidas las variantes de Omicron. Descubrimos que, además de las células dendríticas (DC), una célula presentadora de antígeno profesional clásica (APC), las células epiteliales nasales (NEC) también son importantes para la presentación de CCD/RBD-HR para la activación de células T. Es importante destacar que revelamos el mecanismo subyacente al identificar el ácido siálico (Neu5Ac) como una molécula clave que media en la unión de antígenos administrados por vía intranasal a NEC en presencia de CCD.

CCD se mezcló con las proteínas del antígeno RBD-HR para la administración intranasal (Fig. 1a). En este trabajo, se utilizó PEI 1.8 kDa como precursor para fabricar CD-1.8k mediante el método solvotérmico. Luego, se preparó CCD con un enlazador para polimerizar CD-1.8k a través de la reacción de apertura del anillo. El grupo hidroxilo introducido por el enlazador podría mejorar la capacidad antisuero de CCD para prolongar su tiempo de circulación sanguínea18. En el espectro de RMN 1H de CCD, los picos que oscilan entre 3,75 y 4,00 ppm indicaron la existencia del grupo hidroxilo introducido (Fig. 1 complementaria). La absorción de banda ancha a ~3400 cm−1 del espectro CCD FT-IR sugirió la existencia de grupos –OH y N–H (Fig. 1b). La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) mostró que los grupos C=O y N–H estaban presentes en la estructura de CCD, de acuerdo con los resultados de FT-IR (Fig. 1c). Los resultados anteriores mostraron que los abundantes grupos hidroxilo presentes en la estructura química dotaron a CCD de buena hidrofilia y mejoraron su capacidad antisuero para prolongar el tiempo de circulación sanguínea18, mientras que el grupo amina proporcionó una carga superficial positiva para CCD. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostró que, debido a la reticulación del compuesto enlazador, las partículas CCD tendían a agregarse, lo que resultaba en un tamaño de partícula mayor que el CD (Fig. 1d). El escape lisosomal es un paso que determina la velocidad en la entrega de nanopartículas. Por lo tanto, el experimento de titulación ácido-base se llevó a cabo para investigar la capacidad amortiguadora de CCD en los lisosomas (pH ~ 4) y el entorno fisiológico (pH ~ 7.4) (Fig. 1e). En el rango de pH de 4,0 ~ 7,4, el consumo de NaOH de CCD es mayor que el de PEI 1,8k, lo que indica una capacidad amortiguadora superior de CCD, que puede producir una fuerte esponja de protones para promover el escape lisosomal19.

a La ruta de síntesis de CCD. b Las etapas químicas superficiales de CCD se caracterizan por XPS. c La estructura química de CCD, CD-1.8k y PEI 1.8 kDa medida por FT-IR. d La morfología de CD-1.8k (izquierda) y CCD (derecha) observada por TEM. e Perfiles de valoración ácido-base de CCD, CD-1,8k, PEI 1,8 kDa y soluciones de NaCl 150 mM. f, g Los potenciales zeta (f) y los tamaños de partículas (g) de CCD/RBD-HR con diferentes proporciones de masa. h La capacidad de carga de CCD/RBD-HR con diferentes proporciones de masa (2 μg RBD-HR para cada prueba). n = 3 experimentos independientes por grupo en (f–h). i La morfología de CCD/RBD-HR con una proporción de masa de 10:1 fue observada por TEM. Los datos se presentaron como valores medios ± SEM en (f-h). Se obtuvieron resultados similares para d e i en tres experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Nuestro grupo expresó con éxito la proteína trímera recombinante RBD-HR del antígeno SARS-CoV-2, cuya carga superficial se determinó en aproximadamente -8 mV (Fig. 1f). Encontramos que debido a la presencia del grupo amino residual, el potencial zeta de CCD fue altamente positivo: +32 mV, en comparación con +20 mV de la mezcla CCD/RBD-HR (Fig. 1f). Con el aumento de la relación de masa de CCD: RBD-HR, CCD podría encapsular RBD-HR en nanopartículas estables y más pequeñas (Fig. 1g). El tamaño de partícula de CCD/RBD-HR (10:1) es de ~60 nm, en comparación con <20 nm de CCD/RBD-HR (30:1), el último de los cuales es fácilmente capturado y limpiado por el sistema reticuloendotelial según a informes anteriores20. Por lo tanto, los siguientes estudios de vacunas se realizaron utilizando una relación de masas de 10:1 (CCD:RBD-HR). Mientras tanto, se probó la capacidad de carga RBD-HR de CCD. Cuando la proporción de masa de CCD/RBD-HR fue de 10:1, alcanzó la tasa máxima de transporte de antígenos en aproximadamente el 100 % (Fig. 1h). CCD/RBD-HR (10:1) podría formar nanopartículas esféricas estables (Fig. 1i), que podrían proteger a RBD-HR de la degradación enzimática en la cavidad nasal durante la inmunización intranasal14. Por lo tanto, con una simple mezcla, RBD-HR podría unirse a CCD para formar nanopartículas estables como resultado de interacciones electrónicas.

Los animales se inmunizaron por vía intranasal los días 0, 14 y 28 con una dosis de inmunización de 100 μg de CCD más 10 μg de RBD-HR (por ratón) o 200 μg de CCD más 20 μg de RBD-HR (por conejo) (Fig. 2a). Observamos que los títulos de IgG específicos de antígeno en el suero fueron órdenes de magnitud más altos cuando se administró RBD-HR con CCD que cuando se administró RBD-HR solo en ratones (Fig. 2b) y conejos (Fig. 2c). El análisis de subtipos de anticuerpos reveló la producción de anticuerpos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c e IgG3 en ratones, lo que sugiere la inducción de respuestas inmunitarias sesgadas tanto T helper tipo 1 (Th1) como Th2 mediante la inmunización CCD/RBD-HR (Fig. 2a–e). Los anticuerpos séricos aumentados fueron altamente funcionales, lo que bloqueó la unión específica entre los receptores RBD y ACE2 (Fig. 3a, b complementaria) y neutralizó los virus y pseudovirus auténticos del SARS-CoV-2 (Fig. 2d, e). Además, los sueros inmunes de ratones inmunizados con RBD-HR con adyuvante de CCD protegieron ampliamente contra la infección con las cepas mutantes comunes y de tipo salvaje (WT) de SARS-CoV-2, incluidas las variantes Alfa, Beta, Delta y Omicron ( BA.1, BA.2, BA.2.12.1, BA.3 y BA.4/5) (fig. 2e)21. A continuación, analizamos la producción de anticuerpos IgA específicos de antígeno. Como se esperaba, se indujeron vigorosas respuestas de anticuerpos IgA anti-RBD-HR en el líquido de lavado broncoalveolar (BAL) y el suero de ratones vacunados con CCD/RBD-HR pero no en ratones inmunizados con RBD-HR desnudo o PBS (Fig. 2f y Figura complementaria 2f). Esto indicó el establecimiento de una fuerte inmunidad de las mucosas, que juega un papel importante en la defensa de primera línea contra la infección por virus en sitios locales8.

un esquema de inmunización. Se inmunizaron ratones/conejos por vía intranasal con PBS, RBD-HR o CCD/RBD-HR los días 0, 14 y 28. b, c Títulos séricos de IgG anti-RBD-HR en ratones inmunizados (b) y conejos (c) el día 35. d, e Neutralización de virus auténticos (d) y pseudovirus (e) del SARS-CoV-2 por los sueros inmunitarios el día 35. f Niveles de IgA específica de RBD-HR en líquido BAL el día 35. Ratones inmunizados fueron desafiados con 5 × 105 TCID50 de virus Omicron y sacrificados a 4 dpi. g Niveles de ARN viral en los cornetes nasales, la tráquea y los pulmones a 4 ppp. h Cambios histopatológicos (izquierda) y puntuaciones patológicas (derecha) de los tejidos pulmonares a 4 ppp. Barra de escala: 100 μm. Se obtuvieron resultados similares en cinco experimentos independientes. i, j Niveles séricos de IgG específicos de RBD-HR (i) y su función en la neutralización de variantes de pseudovirus del SARS-CoV-2 (j) el día 260. El día 56, sangre (k), médula ósea (l) y bazo (m) se recolectaron para evaluar las ASC de IgG específicas de SARS-CoV-2 RBD con ELISpot. Se mostraron imágenes (izquierda) y cuantificación (derecha) de células formadoras de manchas de IgG entre los linfocitos. Las células plasmáticas CD138+ productoras de IgG específicas de RBD en la sangre y la médula ósea (n), las células B de memoria (RBD+CD38+CD80+) en la sangre, la médula ósea y el bazo (o) se analizaron con FCM. p, q Las células T CD4+/CD8+ experimentadas con antígeno (CD44+) y activadas (CD69+) en el bazo se determinaron con FCM después de la reestimulación con grupos de péptidos de proteína RBD. Se evaluó la expresión de IL-4 e IFN-γ en células T CD4+ y CD8+ esplénicas con tinción de citoquinas intracelulares después de la reestimulación con grupos de péptidos de proteína RBD o antígenos irrelevantes. Los datos se mostraron con barras flotantes en (k–r). La línea del medio indica la mediana y el cuadro muestra el rango de datos. Los datos se presentaron como valores medios ± SEM. n = 4–5 ratones en (b, d–r). n = 3 conejos en (c). Los valores de P se calcularon con ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett en (b, c, f–i, k–q). ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak en (d, e y j). ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey en (r). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, buscamos evaluar la actividad protectora de la vacuna RBD-HR con adyuvante de CCD en ratones BALB/c hembra WT que son sensibles a la infección por la variante Omicron22. Después de la vacunación con PBS, CCD o CCD/RBD-HR, los ratones fueron desafiados por vía intranasal con 5 × 105 dosis infectiva de cultivo de tejidos al 50 % (TCID50) de SARS-CoV-2 Omicron. Cuatro días después de la infección (dpi), se sacrificó a los ratones y se recolectaron los cornetes nasales, la tráquea y los pulmones para evaluar la carga viral. La vacunación intranasal con CCD/RBD-HR confirió una protección completa contra la infección por Omicron tanto en las vías respiratorias superiores como en las inferiores, según lo determinado por un ARN viral casi indetectable en los cornetes nasales, la tráquea y los pulmones (Fig. 2g). La evaluación histopatológica reveló infiltración mínima o nula en los pulmones de ratones vacunados con CCD/RBD-HR a 4 ppp en comparación con la inflamación aparente en ratones inmunizados con PBS o CCD solo (Fig. 2h).

Dado el estado pandémico en curso del SARS-CoV-2, la persistencia de las respuestas de anticuerpos es fundamental. Se observó una respuesta inmune humoral menguante a la vacuna BNT162b2 COVID-19 autorizada seis meses después de la inmunización de segunda dosis23. En nuestros experimentos, después de la inmunización de RBD-HR con CCD, los títulos de anticuerpos IgG específicos de RBD-HR en el suero permanecieron relativamente altos 260 días después de la inmunización inicial, que fue comparable al día 35 (Fig. 2i). El suero recolectado el día 260 de ratones inmunizados con CCD/RBD-HR fue activo en la neutralización de la infección de pseudovirus tanto ancestrales como mutantes de SARS-CoV-2 (Fig. 2j).

La inmunidad vacunal ideal consiste en inmunidad humoral y celular24. Por lo tanto, a continuación investigamos la activación de las respuestas de células T y células B específicas de antígeno tanto a nivel local como sistémico después de la vacunación. Los ratones se inmunizaron como se mencionó anteriormente. Cuatro semanas después de la tercera inmunización, los linfocitos de la sangre, la médula ósea y el bazo se recolectaron y analizaron mediante ELISpot y citometría de flujo (FCM). El análisis ELISpot con proteína RBD indicó que la inmunización con CCD/RBD-HR indujo altos niveles de células secretoras de anticuerpos (ASC) IgG específicas de RBD en la sangre, la médula ósea y el bazo, mientras que el control RBD-HR no lo hizo (Fig. 2k– metro). Se produjo una proteína RBD marcada con fluorescencia para eliminar las células B que se unen a RBD (Fig. 4a complementaria). De manera similar, encontramos que la inmunización con CCD / RBD-HR resultó en una elevación en la frecuencia de células plasmáticas (PC) CD138 + productoras de IgG específicas de RBD en la circulación y la médula ósea con FCM (Fig. 2n, Fig. 4b-d complementaria) ), apoyando aún más la activación de fuertes respuestas de células B. Las células B de memoria (MBC, CD38+CD80+) pueden mejorar las respuestas de recuperación rápida tras una exposición secundaria25. Como adyuvante de la mucosa, CCD promovió sustancialmente la expansión de MBC específicos de RBD en la sangre, la médula ósea y el bazo (Fig. 2o, Fig. 4e complementaria), lo que explica la sostenibilidad de la inmunidad humoral. A continuación, se aislaron células T CD3+ esplénicas de los ratones inmunizados y se estimularon ex vivo con grupos de péptidos superpuestos para RBD. Se usaron péptidos para el antígeno modelo OVA (OVA257–264 y OVA323–339) como control de antígeno irrelevante. Después de la reestimulación con péptidos RBD en lugar de péptidos OVA, las células CD4 T+ y CD8 T+ experimentadas con antígeno (CD44+) y activadas (CD69+) en el bazo se elevaron significativamente en ratones vacunados con CCD/RBD-HR (Fig. 2p, q, Suplementario Figura 5a, b). La producción de interferón-γ (IFN-γ) e interleucina-4 (IL-4) se determinó mediante tinción de citoquinas intracelulares. Observamos una mayor proporción de células esplénicas CD4 T+ y/o CD8 T+ que expresan IL-4 e IFN-γ en ratones inoculados con CCD/RBD-HR en comparación con la inmunización pura con RBD-HR (Fig. 2r, Fig. 5c complementaria), demostrando la activación sistémica de la inmunidad de células T específica de antígeno.

Para evaluar el efecto de la inmunización intranasal sobre la inmunidad de la mucosa, los ratones vacunados se sacrificaron 4 semanas después de la última vacunación para determinar las respuestas inmunitarias en los pulmones, líquido BAL y drenaje de los ganglios linfáticos cervicales (CLN). Se observó un aumento sustancial en las frecuencias de las células auxiliares foliculares T (Tfh, CD4+CXCR5+PD-1+) y del centro germinal B específico del antígeno (GCB, GL7+CD95+RBD+) en el CLN en el CCD/RBD- Grupo HR en comparación con la inmunización con RBD-HR solo (Fig. 3a, Fig. 6a, b complementaria), que fue fundamental para la generación de una inmunidad humoral fuerte y a largo plazo contra el SARS-CoV-226,27. Luego, también probamos las respuestas de células T específicas de antígeno en los pulmones después de la inmunización. Los tejidos pulmonares se recolectaron 4 semanas después del refuerzo y las células T se evaluaron con FCM. La reestimulación con un grupo de péptidos RBD indujo una elevación notable en la frecuencia de células CD8+ y CD4 T+ generadoras de IFN-γ en los pulmones de ratones que recibieron la vacuna CCD/RBD-HR (Fig. 3b, c, Fig. 7 complementaria). Por el contrario, la reestimulación de antígeno irrelevante mostró efectos mínimos en la producción de IFN-γ, lo que indica la inducción de respuestas de células T específicas de antígeno. Dado que los multímeros del complejo principal de histocompatibilidad I (MHC I) y MHC II específicos de RBD-HR no estaban disponibles en el momento de este estudio, utilizamos el antígeno modelo OVA para verificar aún más la generación de respuestas de células T específicas de antígeno. La inducción de respuestas de células T específicas de OVA en los pulmones se evaluó mediante tinción con tetrámero OVA257–264 restringido por H-2Kb (SIINFEKL) y OVA323–339 restringido por I-Ad. Como se muestra en la figura complementaria 8a, b, la adición de adyuvante CCD indujo un fuerte aumento en la producción de células T CD4+ y CD8+ positivas para tetrámero.

a Los porcentajes de células Tfh (CD4+CXCR5+PD-1+) y GCB específicas de RBD (B220+GL7+CD95+RBD+) en el CLN se analizaron con FCM a los 28 días de la última inmunización. b, c Se evaluó la generación de IFN-γ en células T CD8+ y CD4+ de pulmón mediante FCM tras la reestimulación con grupos de péptidos RBD o antígenos irrelevantes. b Gráficas representativas de FCM (izquierda) y cuantificación (derecha) de células T CD8+ de pulmón que expresan IFN-γ. d La proporción de células T CD4+ y CD8+ experimentadas con antígeno (CD44+) que expresan CD69 y CD103 en tejidos pulmonares. e El porcentaje de DC CD103+ que coexpresan CD86 y MHC II en los pulmones. f Parte superior izquierda: los mapas de t-SNE se crearon concentrando células T CD3+ del líquido BAL de los ratones vacunados. El análisis se llevó a cabo con el software predeterminado FlowJo V.10. Superior derecha e inferior: proyecciones de mapas de calor de la expresión de CD4, CD8, CD44, CD69 y CD103 en mapas t-SNE de tres ratones independientes (n = 3). Los círculos con rayas rojas y negras son indicadores de células TRM CD4+ y CD8+ experimentadas con antígeno en el líquido BAL, respectivamente. g Números absolutos de células T CD8+ que producen IFN-γ (izquierda) y TNF-α (derecha) en el LBA después de la reestimulación ex vivo con grupos de péptidos RBD o antígeno irrelevante 4 semanas después de la última inmunización. h Cuantificación de los porcentajes (izquierda) y los números (derecha) de MHC II+ AM en el líquido BAL. Los datos se mostraron con barras flotantes en (a–e, g y h). La línea del medio indica la mediana y el cuadro muestra el rango de datos. Los datos se presentaron como valores medios ± SEM. n = 4–6 ratones en cada grupo en (a–e, g y h). Los valores de p en a, d, e, h se calcularon con ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Dunnett. Los valores de p en b, c y g se calcularon con ANOVA de dos vías seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La evidencia acumulada indica el papel crítico de las células T de memoria residentes en tejidos de la mucosa (TRM) en la defensa del huésped contra la infección viral28. Por lo tanto, a continuación exploramos si CCD podría promover la formación de células TRM de la mucosa respiratoria. Los ratones vacunados con CCD/RBD-HR exhibieron una marcada mejora en los porcentajes y números de células T CD4+ y CD8+ experimentadas con antígeno en los pulmones (Figura 9 complementaria, Figura 10a-d complementaria) cuatro semanas después de la última inmunización. El aumento de las células T CD4+ y CD8+ experimentadas con el antígeno tras la exposición al CCD expresó niveles sustancialmente elevados de CD69, CD103 o ambos, que son marcadores típicos para los TRM inducidos por la vacuna (Fig. 3d, Fig. 10e-g complementaria)29,30. Estos datos sugirieron la capacidad de CCD para guiar la formación de células TRM pulmonares después de la vacunación, incluidas las células TRM tanto CD4+ como CD8+. Como se informó anteriormente30, especulamos que la formación de células TRM pulmonares requiere la migración de células T desde los ganglios linfáticos de drenaje, al menos después de la inmunización principal, ya que encontramos que las células T CD4+CD69+ y CD8+CD69+ en los ganglios linfáticos de drenaje se redujeron a la inversa en ratones inmunizados con CCD / RBD-HR (Figura complementaria 11a, b). Siete días después de la tercera inmunización, descubrimos que la vacunación CCD/RBD-HR provocó un aumento de aproximadamente tres veces en la fracción de DC residentes en los pulmones (CD103+) que expresaban altos niveles de los marcadores de activación CD86 y MHC II en ratones inmunizados en comparación con ratones puros. RBD-HR (Fig. 3e).

A continuación, evaluamos las células TRM dentro de las vías respiratorias (BAL) 4 semanas después de la inmunización final. Los mapas de t-SNE se establecieron en función de las células T CD3+ agrupadas del líquido BAL y se produjeron mapas de calor para superponer las intensidades de expresión de CD4, CD8, CD44, CD69 y CD1036. La administración intranasal de CCD/RBD-HR contribuyó a una elevación drástica de las células CD4+, CD8+ y CD4+ o CD8 T+ en las vías respiratorias (Fig. 3f). Mientras tanto, observamos la formación de varios grupos grandes de células T CD4+ y CD8+ con fenotipos TRM después de la vacunación intranasal con CCD/RBD-HR (Fig. 3f). También determinamos células T específicas de antígeno con expresión intracelular de IFN-γ y TNF-α en células mononucleares del BAL con FCM tras la reestimulación ex vivo con grupos de péptidos para el control de péptidos RBD u OVA. Como era de esperar, las células T CD8+ de ratones inmunizados con CCD/RBD-HR respondieron a los grupos de péptidos para RBD cuatro semanas después del último refuerzo (Fig. 3g). Para evaluar la activación de la inmunidad innata, se recolectaron fluidos BAL siete días después de la tercera inmunización. Los resultados indicaron que, además de activar fuertes respuestas inmunitarias adaptativas, la inmunización con CCD/RBD-HR también indujo una respuesta robusta de macrófagos alveolares entrenados (AM) dentro de las vías respiratorias (Fig. 3h), que se caracteriza por la coexpresión de MHC II y CD11b y puede ser vital en el control inmunitario innato temprano de COVID-196,31.

Para investigar la respuesta inmunitaria innata, se determinó el reclutamiento de células inmunitarias en CLN con FCM 72 h después de la vacunación (Fig. 12 complementaria)32. Como se muestra en la Fig. 4a, CCD/RBD-HR indujo un mayor reclutamiento de monocitos infiltrantes, CD11b− DC y CD11blow DC que RBD-HR puro. Otras células inmunitarias, incluidos los macrófagos, los eosinófilos, los neutrófilos y las DC mieloides (mDC), no cambiaron en la CLN. A continuación, exploramos el impacto de CCD/RBD-HR en las APC más enfocadas, las DC, que son fuertes en la presentación de antígenos a las células T ingenuas33. Etiquetamos RBD-HR con 488 tintes fluorescentes para visualizar o cuantificar su interacción con diferentes células. La captación de antígenos por DC derivadas de médula ósea (BMDC) se evaluó con FCM utilizando el RBD-HR marcado con fluorescencia. Descubrimos que la incubación de RBD-HR desnudo mostró una incorporación de antígeno modesta, mientras que RBD-HR mezclado con CCD mostró un fuerte aumento en la absorción de antígeno por parte de BMDC (Fig. 4b). También observamos que la inmunización con CCD/RBD-HR, en lugar de RBD-HR solo, promovió la maduración de las CD en el CLN de drenaje en ratones, caracterizada por la elevación en la expresión de los marcadores de maduración CD40, CD80, CD86 y MHC II. (Figura 4c). La incubación de BMDC con CCD/RBD-HR durante 24 h también dio como resultado una elevación notable en la expresión de CD40 y CD80 in vitro (Fig. 4d)34. Un ensayo Luminex magnético reveló que el tratamiento con CCD/RBD-HR mejoró la producción de múltiples citoquinas proinflamatorias de las BMDC, incluidas IL-1β, IL-6, MCP-1, etc. (Fig. 4e). La presentación eficiente de antígenos por parte de las APC es fundamental para el inicio de las respuestas inmunitarias35. A continuación, marcamos las células T esplénicas con fluorescencia CFSE y las incubamos con BMDC preestimuladas con PBS, RBD-HR o CCD/RBD-HR. Las BMDC tratadas con CCD/RBD-HR, pero no con RBD-HR, indujeron un grado significativamente elevado de proliferación y activación (CD69+, CD44+) en las células T CD4+ y CD8+ (Fig. 4f-h), junto con una mayor secreción de IL-4 e IFN-γ en los sobrenadantes (Fig. 4i) durante el proceso de cocultivo. Por lo tanto, la activación concomitante de DC puede estar implicada en el mecanismo del efecto de CCD sobre la inmunidad mejorada después de la inmunización intranasal.

a El reclutamiento de células inmunitarias en CLN 72 h después de la inmunización intranasal con PBS, RBD-HR o CCD/RBD-HR se determinó con FCM. b Captación de RBD-HR después de incubar BMDC de ratón con o sin CCD durante 30 min. c Maduración de DC en CLN 72 h después de la inmunización intranasal con PBS, RBD-HR o CCD/RBD-HR según lo determinado por la expresión de CD40, CD80, CD86 y MHC II. d, e Los BMDC se trataron con PBS, RBD-HR o CCD/RBD-HR durante 24 h. d La maduración de las BMDC se determinó mediante la expresión de CD40 y CD80 con FCM. e Prueba de ensayo magnético Luminex de citocinas en el sobrenadante. La proliferación (f) y las fracciones de CD69+ (g) y CD44+ (h) de las células T CD4+ y CD8+ se determinaron con FCM después de coincubar las células T con DC preestimuladas durante 48 h. (i) Las citocinas (IL-4 e IFN-γ) en el sobrenadante se determinaron mediante ELISA. Los datos se mostraron con barras flotantes en (a–d) y (f–i). La línea del medio indica la mediana y el cuadro muestra el rango de datos. Los datos se presentaron como valores medios ± SEM. n = 5 ratones por grupo en ay c. Se realizaron tres experimentos independientes (n = 3) en cada grupo en (b, d-i). Los valores de P se calcularon con ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparaciones múltiples de Dunnett. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además de las APC profesionales, estudios recientes indicaron que las células epiteliales presentadoras de antígenos pueden presentar antígenos en sitios locales, lo cual es esencial para la regulación de la inmunidad del tejido de barrera, incluido el reclutamiento y mantenimiento de células TRM36,37,38. Usando los antígenos marcados con fluorescencia, observamos que el CCD/RBD-HR suministrado por vía intranasal, pero no el RBD-HR desnudo, todavía podía unirse universalmente a la capa del epitelio nasal 24 h después de la inmunización intranasal. (Figura 5a). La tinción inmunohistoquímica reveló que 30 minutos después de la inmunización, la densidad de RBD-HR en la mucosa nasal fue mucho mayor cuando se incorporó al CCD (Fig. 13 complementaria). 24 h más tarde, el RBD-HR desnudo se eliminó casi por completo de la cavidad nasal, mientras que se observó una mayor unión y penetración de RBD-HR entre los NEC cuando se administró con CCD. A continuación, determinamos si los NEC pueden presentar la vacuna administrada por vía intranasal, que se puede discriminar en función de su expresión de la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM)36.

a Imágenes inmunofluorescentes representativas de la mucosa nasal obtenidas de ratones BALB/c (n = 3) inmunizados con PBS o RBD-HR (verde) con o sin CCD por vía intranasal 24 h antes. Azul: DAPI. Barras de escala: 100 μm. b Izquierda: Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 3) con PBS o RBD-HR marcado con fluorescencia con o sin CCD por vía intranasal. 24 h más tarde, se recogió la mucosa nasal y se evaluó la captación de RBD-HR por NEC primarios (EpCAM+) con FCM. Derecha: absorción de RBD-HR por NEC primarios aislados ex vivo después de la incubación con RBD-HR con o sin CCD durante 30 min. c Maduración de NEC de ratón 24 h después de la inmunización según lo determinado por la expresión de CD40, CD80, CD86 y MHC II usando FCM. n = 3 ratones por grupo. d Se estimuló una línea celular NEC de ratón con PBS, RBD-HR y CCD/RBD-HR durante 24 h y se examinó la expresión de los marcadores de maduración. Los NEC de ratón se aislaron y se incubaron con PBS o RBD-HR marcado con fluorescencia (verde) con o sin CCD durante 24 h. Se utilizó microscopía confocal para obtener imágenes de la localización de RBD-HR (verde) y MHC II (rojo) en los NEC primarios. Azul: DAPI. Barras de escala: 10 μm. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. f Concentración de IL-6 en el sobrenadante de la línea celular NEC estimulada a las 24 h. g, h Los NEC primarios de ratón se aislaron y estimularon con PBS, RBD-HR o CCD/RBD-HR en presencia o ausencia de anticuerpos anti-MHC II durante 24 h, seguido de cultivo conjunto con células T esplénicas. 48 h más tarde, las fracciones de células T CD4+CD44+ y CD4+CD69+ se evaluaron con FCM. Los datos se mostraron con barras flotantes en (b–d) y (f–h). La línea del medio indica la mediana y el cuadro muestra el rango de datos. Los datos se presentaron como valores medios ± SEM de tres (n = 3) en b, g y cuatro (n = 4) experimentos independientes en (d, f, h). Los valores de P se calcularon con ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparaciones múltiples de Dunnett. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los ratones se inmunizaron por vía intranasal con el RBD-HR marcado con o sin CCD. 24 h más tarde, se recogió la mucosa nasal y se examinó con FCM la captación de antígenos en EpCAM+ NEC. Sorprendentemente, los NEC solo pueden adoptar RBD-HR cuando se mezcla con CCD (Fig. 5b). Se observó el mismo resultado cuando se aislaron NEC de la mucosa nasal y se trataron con RBD-HR o CCD/RBD-HR ex vivo (Fig. 5b). Descubrimos que CCD podría producir una esponja de protones fuerte para promover el escape lisosomal (Fig. 14 complementaria), lo que contribuyó a su buena capacidad de amortiguación, como se demuestra en la Fig. 1e. También encontramos que el tratamiento con CCD/RBD-HR promovió significativamente la maduración de NEC al aumentar la expresión de MHC II y moléculas coestimuladoras (CD40, CD80, CD86) tanto in vivo (Fig. 5c) como in vitro con una línea celular NEC de ratón. (Figura 5d). La microscopía confocal mostró más antígenos RBD-HR colocalizados con MHC II en NEC primaria tratada con CCD/RBD-HR, lo que sugiere una presentación más efectiva de antígenos tras la estimulación CCD (Fig. 5e). Se observó una producción mejorada de IL-6 en el sobrenadante cuando las líneas celulares NEC se estimularon con CCD/RBD-HR (Fig. 5f). Similar a lo que se observó en los BMDC, los NEC primarios preestimulados con CCD/RBD-HR promovieron la proliferación (Fig. 6d) y aumentaron las fracciones de células T CD4+ activadas y experimentadas con antígeno (Fig. 5g), lo que se revirtió por completo. por un anticuerpo neutralizante específico contra MHC II (Fig. 5h). También descubrimos un aumento significativo en la proporción de células T CD8+ proliferadas tras el cocultivo con la línea celular NEC estimulada con CCD/RBD-HR (Fig. 6e). En conjunto, estos datos respaldaron firmemente el papel de las NEC como APC potentes que pueden presentar antígenos y activar las células T en sitios locales. Teniendo en cuenta que el número de NEC supera con creces el de APC profesionales en la mucosa nasal, los NEC pueden desempeñar un papel indispensable en la inducción de inmunidad específica de antígeno después de la vacunación de la mucosa con CCD/RBD-HR.

una evaluación FCM de los porcentajes de RBD-HR marcados con His que se unen a NEC primarios (n = 3, arriba a la izquierda), líneas NEC (n = 4, arriba a la derecha) y BMDC (n = 3, abajo) en presencia de CCD cuando las células se pretrataron con NA o se trataron con Neu5Ac. Las células no tratadas o las células tratadas con CCD y RBD-HR marcado con His se usaron como controles negativos y positivos, respectivamente. NA: neuraminidasa; Neu5Ac: ácido siálico. b Microscopía de fluorescencia de líneas celulares NEC después de la incubación con RBD-HR marcado con His (verde) y CCD en presencia o ausencia de NAs/Neu5Ac. Azul: DAPI. Barras de escala: 25 μm. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. Se inmunizaron ratones c BALB/c (n = 3) por vía intranasal con CCD y RBD-HR marcado con His en presencia o ausencia de Neu5Ac. Un grupo de ratones fue pretratado con NA por vía intranasal antes de recibir CCD/RBD-HR. La unión de RBD-HR marcado con His (verde) a la mucosa nasal se evaluó con un microscopio de inmunofluorescencia. Azul: DAPI. Barras de escala: 25 μm. d, e Las líneas NEC de ratón se trataron con CCD y RBD-HR con o sin NAs/Neu5Ac durante 24 h antes del cocultivo con células T esplénicas marcadas con CFSE. La proliferación y las fracciones de CD69+ y CD44+ de las células T CD4+ (d) y CD8+ (e) se determinaron con FCM después de 48 h de cocultivo. f Se vacunaron ratones BALB/c (n = 5/grupo) por vía intranasal con CCD/RBD-HR con o sin tratamiento previo con NA/tratamiento con Neu5Ac. El día 14 después de la vacunación, se detectaron anticuerpos IgG anti-RBD-HR en los sueros. g Captación de RBD-HR marcado con fluorescencia por líneas NEC en presencia de CCD cuando las células se trataron a 4 °C o con citocalasina D, nocodazol, genisteína y clorpromazina. h Ilustración esquemática de los mecanismos de la vacuna. Los datos se mostraron con barras flotantes en (a) y (d-f). La línea del medio indica la mediana y el cuadro muestra el rango de datos. Los datos se presentaron como valores medios ± SEM de tres experimentos independientes (n = 3) en (d, e, g). Los valores de P se calcularon con ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparaciones múltiples de Dunnett. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, investigamos cómo los NEC adoptaron CCD/RBD-HR utilizando RBD-HR marcado con His. Una proporción marcadamente mayor de NEC primarias aisladas y líneas celulares NEC fueron positivas para la unión de RBD-HR cuando se trataron con CCD / RBD-HR durante 30 minutos en relación con el tratamiento RBD-HR puro, según lo determinado con FCM (Fig. 6a). Luego exploramos cómo CCD promueve la unión de antígenos a las células epiteliales. Neu5Ac son carbohidratos ubicuos ubicados en el extremo de las glicoproteínas y glicolípidos en la superficie de las células eucariotas, que son altamente responsables de la carga negativa de la superficie celular y se ha informado que median la unión viral y la entrada en las células huésped39,40,41. Teniendo en cuenta la propiedad catiónica de CCD, planteamos la hipótesis de que CCD puede promover la unión al antígeno al interferir con Neu5Ac. Por lo tanto, pretratamos las células epiteliales con neuraminidasa (NA) para eliminar el Neu5Ac de la superficie celular o incubamos CCD con Neu5Ac con anticipación para evitar su interacción con Neu5Ac en las células. Como se muestra en la Fig. 6a, tanto el tratamiento previo con NA como la incubación con Neu5Ac obstaculizaron gravemente la unión del antígeno a las líneas NEC y NEC primarias. La misma tendencia se confirmó aún más usando microscopía de fluorescencia en líneas NEC (Fig. 6b). Sin embargo, el tratamiento con NA o Neu5Ac no tuvo un efecto significativo en la unión de RBD-HR a BMDC, lo que indica que la unión de antígenos a BMDC promovida por CCD depende de otros mecanismos en lugar de Neu5Ac (Fig. 6a). También se observó in vivo una unión reducida de RBD-HR a la mucosa nasal cuando los ratones fueron pretratados por vía intranasal con NA antes de la inmunización con CCD/RBD-HR o tratados con CCD/RBD-HR que contenía Neu5Ac en comparación con la administración de CCD/RBD-HR únicamente (Fig. 6c). Presumimos que la reducción de la unión al antígeno puede dar como resultado una menor incorporación del antígeno en los NEC que presentan antígenos y respuestas inmunitarias atenuadas. De acuerdo con nuestras expectativas, en presencia de NA o Neu5Ac, las líneas NEC estimuladas con CCD/RBD-HR exhibieron una capacidad reducida para presentar antígenos a las células T CD4+ y CD8+, como lo implica una proporción reducida de células proliferadas, activadas y activadas. y células T experimentadas con antígeno (Fig. 6d, e). Además, los títulos medios geométricos de anticuerpos IgG en suero en ratones inmunizados con CCD/RBD-HR se redujeron cuando los ratones se trataron previamente con NA por vía intranasal (Fig. 6f). Se observaron los mismos resultados cuando se añadió Neu5Ac a la mezcla CCD/RBD-HR antes de la inmunización. Por lo tanto, la inducción de la respuesta inmune humoral por CCD/RBD-HR depende de la unión temprana de antígenos a NEC a través de Neu5Ac.

Luego, exploramos el mecanismo de captación con el RBD-HR marcado con fluorescencia. La tasa de captación celular de RBD-HR disminuyó por debajo del 10 % cuando las líneas celulares NEC se incubaron con CCD/RBD-HR a 4 °C durante 4 h, lo que sugiere un mecanismo dependiente de energía para la entrada celular (Fig. 6g). Luego, las líneas celulares NEC se pretrataron con varios inhibidores de diferentes vías de captación antes de la incubación con CCD/RBD-HR, entre las cuales el tratamiento con citocalasina D resultó en una reducción de más del 80 % en la captación de antígeno, lo que sugiere que la internalización principal de CCD/RBD- La HR en NEC dependía de la micropinocitosis (Fig. 6g) 42. Por lo tanto, CCD puede promover la unión del antígeno a los NEC a través de Neu5Ac y promover aún más la absorción del antígeno a través de la micropinocitosis dependiente de energía.

Para evaluar la seguridad de la vacuna intranasal CCD/RBD-HR, se realizó un hemograma completo (Fig. 7a) y un análisis de panel de química sérica (Fig. 7b) una semana después de la tercera inmunización. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. No se observaron cambios histológicamente significativos en los pulmones, bazo, corazón, riñón, hígado o mucosa nasal de los ratones inmunizados (Fig. 7c).

Se inmunizaron por vía intranasal ratones BALB/c (n = 5 por grupo) con 100 μg de CCD y 10 μg de RBD-HR los días 0, 14 y 28. El día 35, se recolectaron muestras de sangre para evaluar los parámetros del hemograma completo ( a) e índices bioquímicos (b). La línea media es representativa de la mediana, los bigotes son indicadores del rango de valores y el recuadro muestra el rango intercuartílico. c Tinción con hematoxilina y eosina de órganos vitales y mucosa nasal. Barra de escala, 100 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se necesitan con urgencia vacunas contra el SARS-CoV-2 contra los COV emergentes. Lo que está igualmente garantizado son las vacunas contra el SARS-CoV-2 que pueden inducir simultáneamente tanto la inmunidad local de la mucosa en las vías respiratorias como la inmunidad sistémica, que son esenciales para prevenir la infección y la transmisión viral. Hasta la fecha, se están desarrollando más de 100 vacunas mucosas contra la COVID-19 a nivel mundial, con alrededor de 20 candidatas alcanzando la evaluación clínica y 4 vacunas aprobadas para uso de emergencia43,44. Estas vacunas sin aguja se administran por la nariz o la boca en forma de aerosol o gotas. En comparación con otras plataformas de vacunas, las vacunas de proteínas de subunidades poseen las ventajas de una fácil producción en masa, seguridad y transporte conveniente sin necesidad de almacenamiento ultrafrío. Nuestro equipo desarrolló recientemente una vacuna de subunidades triméricas autoensamblables RBD-HR que indujo una inmunidad protectora amplia contra las variantes del SARS-CoV-25 incluidas en omicrones. Sin embargo, como vacunas de la mucosa, los antígenos de proteínas desnudas mostraron una inmunogenicidad deficiente, ya que pueden eliminarse rápidamente mediante la eliminación mucociliar, lo que requiere el desarrollo de adyuvantes de la mucosa8. En este estudio, desarrollamos CCD que mostraron una excelente actividad en la configuración de la formación de inmunidad antiviral inducida por RBD-HR después de la administración intranasal.

La inmunización de tres dosis con CCD/RBD-HR indujo de manera eficiente anticuerpos IgG fuertes y específicos de antígeno en ratones y conejos con actividad de neutralización contra WT y varios COV de los linajes Alfa, Beta, Delta y Omicron. Una vez estimuladas, estas respuestas de anticuerpos neutralizantes pueden durar un largo período de tiempo después de la vacunación, evitando los requisitos de dosis repetidas. Mientras tanto, se detectaron fuertes títulos de IgA tanto en las vías respiratorias como en la circulación, lo que indica el establecimiento de la inmunidad de las mucosas. Por el contrario, no se observaron respuestas de anticuerpos detectables en ratones inmunizados con RBD-HR puro. Además, la vacuna intranasal CCD/RBD-HR también brindó protección contra las cargas virales tanto en el tracto respiratorio superior como en el inferior en ratones BALB/c altamente susceptibles después del desafío con la variante Omicron actualmente dominante.

El mecanismo subyacente de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna se exploró en ratones. Las respuestas defectuosas de las células GCB y Tfh se relacionaron con una durabilidad desregulada y limitada de las respuestas humorales después de la infección por SARS-CoV-245. Aquí encontramos que cuatro semanas después de la tercera inmunización con CCD/RBD-HR, se evocaron respuestas robustas de GCB y Tfh específicas de antígeno en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. 3a). En consonancia, se detectó una alta proporción de MBC específicos de RBD en la sangre, el bazo y la médula ósea tras la exposición a CCD/RBD-HR (Fig. 2p). Estos resultados coincidieron con la durabilidad de las respuestas de IgG en suero (Fig. 2i, j) y demostraron el establecimiento de la memoria inmune humoral a nuestra vacuna intranasal46,47,48. Determinamos además la inmunidad de las células T inducida por el CCD/RBD-HR administrado por vía intranasal. CCD/RBD-HR indujo respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno, incluida una alta proporción de células secretoras de IFN-γ tras la reestimulación ex vivo con grupos de péptidos para RBD. Estos resultados fueron consistentes con los informes de nuestro estudio anterior8. La administración intranasal de CCD/RBD-HR también indujo una robusta inmunidad celular de la mucosa. Se observaron grandes proporciones y números de respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno en los pulmones y líquido BAL en ratones inmunizados con CCD/RBD-HR, en lugar de RBD-HR desnudo, incluidas las células TRM CD103+ y/o CD69+ (Fig. 3b-h, Fig. 10 complementaria). Las células TRM respiratorias son componentes esenciales de la defensa de primera línea contra la infección viral en sitios locales sin recirculación49,50,51. Estudios previos con vacunas COVID-19 vectorizadas con adenovirus indicaron que solo la vacunación intranasal, pero no intramuscular, fue capaz de inducir inmunidad de la mucosa contra el SARS-CoV-26,52. Por lo tanto, CCD es un adyuvante mucoso muy eficaz para las vacunas basadas en proteínas, lo que podría ayudar a generar respuestas inmunitarias fuertes y completas.

Anteriormente mostramos que varios nanotransportadores catiónicos son potentes adyuvantes para una vacuna RBD contra el SARS-CoV-2 que indujo la activación de BMDC con una mayor expresión de marcadores de maduración (CD40, CD86) y secreción de citoquinas inflamatorias53. De manera similar, aquí encontramos que la inmunización con CCD/RBD-HR mejoró el reclutamiento de CD11blow y CD11b-DC en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. 4a), promoviendo la activación de la inmunidad celular54,55. También se observó la activación de las DC después del tratamiento con CCD/RBD-HR tanto in vitro como in vivo, incluidas las DC CD103+ en los tejidos pulmonares, las DC CD11c+ en los ganglios linfáticos y las BMDC. Además, las BMDC preestimuladas con CCD presentaron con éxito antígenos a las células T. Todos estos datos respaldaron que la adyuvancia de CCD se basa en su impacto en los APC clásicos, DC.

El mecanismo subyacente de las vacunas intranasales en sitios locales sigue siendo en gran parte desconocido. Estudios recientes indicaron que las células epiteliales también pueden desempeñar un papel fundamental en la presentación de antígenos en determinadas condiciones36,37. Como las vacunas administradas por vía intranasal primero tocan numerosos NEC en la cavidad nasal, planteamos la hipótesis de que los NEC pueden procesar y presentar antígenos. De acuerdo con nuestras expectativas, la inmunización con CCD/RBD-HR indujo una elevación en la expresión de CD40, CD80, CD86 y MHC II en NEC in vivo (Fig. 5c). Las líneas celulares NEC también mostraron una tendencia a la maduración cuando se estimularon con CCD/RBD-HR in vitro (Fig. 5d). Similar a los resultados de los BMDC, los NEC preestimulados con CCD/RBD-HR presentaron antígenos de manera eficiente a las células T esplénicas aisladas (Fig. 5g), que pueden ser abolidas por un anticuerpo específico contra MHC II (Fig. 5h). Además, como adyuvante, CCD promovió el tiempo de residuo de los antígenos en la superficie de la mucosa y promovió la captación de antígenos en los NEC (Fig. 5a, b). Luego investigamos cómo los antígenos ingresan a los NEC. Dado que los residuos de Neu5Ac son ubicuos en las células de mamíferos y tienen una carga muy negativa39,40,41, especulamos que el CCD con carga positiva puede promover la interacción entre los antígenos y Neu5Ac. No es sorprendente que el pretratamiento con NA o la incubación con Neu5Ac libre atenúe la unión de RBD-HR encapsulado con CCD en NEC, lo que reduce aún más la presentación de antígenos por parte de NEC y reduce las respuestas de IgG en suero en ratones. Teniendo en cuenta el gran número, los NEC pueden desempeñar un papel indispensable en la inducción de respuestas inmunitarias para las vacunas intranasales. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que aclara el papel de los NEC como APC para las vacunas intranasales. Además, determinamos el papel crítico de Neu5Ac en la mediación de las conexiones entre las NEC y las vacunas intranasales adyuvadas por CCD con carga positiva por primera vez.

En conclusión, encontramos que los antígenos RBD-HR adherentes al adyuvante CCD pueden unirse a los NEC a través de Neu5Ac. Esto permite la residencia de los antígenos administrados por vía intranasal en la mucosa nasal, proporcionando tiempo suficiente para la penetración del antígeno en los tejidos epiteliales. Como resultado, los antígenos pueden presentarse con éxito a las células T mediante DC y NEC locales, lo que activa respuestas inmunitarias fuertes y duraderas contra las variantes del SARS-CoV-2 incluidas en Omicron tanto a nivel local como sistémico (Fig. 6h).

Los experimentos de desafío viral del SARS-CoV-2 se realizaron en las instalaciones ABSL-4 del Centro Nacional de Investigación de Primates de Bioseguridad de Alto Nivel de Kunming con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Biología Médica de la Academia China de Ciencias Médicas. Todos los demás experimentos con animales en este estudio se realizaron de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad de Sichuan (Chengdu, Sichuan, China). Se compraron ratones BALB/c y C57BL/6 libres de patógenos específicos (SPF) (5 a 7 semanas, de tipo salvaje) de HFK bioscience company (China) y se mantuvieron a 22–23 °C, 45–55 % de humedad relativa con un ciclo de luz-oscuridad de 12 a 12 h con alimentos y agua gratuitos. Se compraron conejos de Nueva Zelanda a Pizhou Oriental Group. Se eligieron hembras porque los machos son agresivos y, a menudo, pelean y se lastiman, lo que interfiere con la recopilación de datos. Todos los animales se adaptaron durante no menos de una semana antes de los experimentos y se agruparon aleatoriamente.

La polietilenimina ramificada (PEI 1,8 kDa) se obtuvo de Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. La N,N'-bis(2-hidroxietil)etilendiamina, la epiclorhidrina y el dicarbonato de di-terc-butilo se adquirieron de Shanghai Energy Chemical Co., Ltd. Sino Biological proporcionó la proteína RBD recombinante con un fragmento Fc (RBD-Fc) de SARS-CoV-2. Los anticuerpos IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgA de cabra conjugados con HRP y anti-IgG de conejo conjugados con HRP se adquirieron de Southern Biotech. Genomeditech proporcionó pseudovirus SARS-CoV-2 que expresan mucho EGFP o luciferasa, incluidos WT, P.1.617.2, B.1.1.529, BA.1, BA.2, BA.3, BA.4/5 y pseudovirus BA.2.12.1.

Los puntos de carbono catiónicos (CCD) consisten en puntos de carbono derivados de PEI de 1,8 kDa (CD-1,8k) y un compuesto enlazador.

La preparación de CD-1.8k. Brevemente, se disolvieron 5 g de PEI de 1,8 kDa en 30 ml de etanol seco seguido de la adición de 4 ml (30 % en peso) de H2O2 con agitación suave. La solución se transfirió a un autoclave de teflón de 100 ml y se calentó a 185 °C durante 5 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró a través de un filtro de membrana de 0,45 µm para eliminar los sólidos insolubles y el disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria a presión reducida. Después de 24 h de secado al vacío, se obtuvo una sustancia aceitosa espesa de color marrón amarillento y se denominó CD-1.8k.

Elaboración del CCD. El compuesto enlazador se sintetizó de acuerdo con nuestro trabajo previo56. Dicarbonato de di-terc-butilo (40 mmol) y N,N'-bis (2-hidroxietil) etilendiamina (20 mmol) se disolvieron en metanol y se agitaron a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener un producto sólido de color amarillo pálido. Luego, se añadió (6,3 mmol) a una mezcla de epiclorhidrina (37,9 mmol), gránulos de hidróxido de sodio (37,5 mmol), agua (10 mmol) y bromuro de tetrabutilamonio (0,3 mmol) y se agitó durante 4 h a 40 °C. . Después de eso, la mezcla de reacción se filtró y el sólido se lavó con diclorometano. La capa orgánica combinada se secó con sulfato de magnesio anhidro. El disolvente y el exceso de epiclorhidrinas se eliminaron por destilación a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (v/v 4:1, PE:EA) para convertir el compuesto de revestimiento en un aceite incoloro. Luego, se disolvieron 300 mg de CD-1.8k y 150 mg de enlazadores en 3 mL de etanol destilado y se hicieron reaccionar a 80 °C durante 72 h bajo la protección de N2. Después de eliminar el disolvente, se añadieron a la mezcla de reacción 5 ml de ácido trifluoroacético (TFA) y 5 ml de CH2Cl2 y se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se disolvió en 3 mL de agua desionizada y se purificó por diálisis (MWCO 3500) frente a una solución de HCl 0,1 N durante 2 días y agua desionizada durante 1 día (el dializado se cambió durante 12 h) . Luego, los productos se obtuvieron como aceite marrón después de la liofilización, lo que se denominó CCD.

Los antígenos RBD-HR utilizados en este estudio se prepararon como se describió anteriormente5. Brevemente, se aplicó el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) para expresar las proteínas triméricas RBD-HR. La secuencia S-RBD de la variante Delta se vinculó directamente a las secuencias HR1 y HR2 en la subunidad S2 del SARS-CoV-2. El gen sintético se amplificó y se incorporó al vector pFastBac1, que luego se transformó en células de Escherichia coli DH10b para la clonación. Los bácmidos recombinantes resultantes se transfectaron luego en células de insecto Sf9 (proporcionadas por nuestro laboratorio) para la producción de antígenos. Las proteínas se purificaron con una columna HisTrap Excel (GE Healthcare) y una columna Superdex 200 Increment 10/300 GL (GE Healthcare). Se usó proteasa EK para escindir las proteínas durante el paso de purificación. La pureza de RBD-HR se determinó con SDS‒PAGE y tinción con azul de Coomassie, así como con transferencia Western (anticuerpo S, Sino Biological) antes de su uso.

Los espectros de 1H-NMR de PEI 1,8 kDa, CD-1,8k, conector y CCD se midieron en un espectrómetro Bruker AM400 NMR con D2O como disolvente. Las etapas químicas superficiales de CCD se exploraron mediante espectroscopia electrónica en un AXIS Supra (Kratos Analytical, Reino Unido). Los espectros FI-IR de PEI 1,8 kDa, CD-1,8k y CCD se obtuvieron con un IRTracer-100 (Shimadzu, Japón). CCD se mezcló con RBD-HR durante 30 min a 25 °C en una cierta proporción con agua ultrapura como sustancia soluble para obtener nanopartículas de CCD/RBD-HR. La suspensión de las nanopartículas CD-1.8k, CCDs o CCD/RBD-HR se dejó caer sobre una rejilla de cobre y luego se secó al aire, y se observaron sus morfologías con microscopía electrónica de transmisión (TEM, Tecnai G2 F20 S-TWIN, Thermo Fisher, Estados Unidos). Los potenciales zeta y los diámetros hidrodinámicos medios de las nanopartículas RBD-HR, CCD o CCD/RBD-HR se midieron con un analizador Zetasizer (Malvern Instruments Ltd., Reino Unido).

La dosis de RBD-HR se fijó en 1 μg/μL (100 μL), y se obtuvieron nanopartículas CCD/RBD-HR con diferentes relaciones de masa incubando su mezcla durante 30 min a temperatura ambiente con 200 μL de agua ultrapura como sustancia soluble. . Luego, las muestras se colocaron en un tubo de filtración microcentrífuga de corte de 100 kDa (0,5 ml, Beyotime Biotechnology) pretratado con agua ultrapura y centrifugado a 15 000 × g durante 60 min. El filtrado se analizó mediante un kit de ensayo de proteínas BCA (P0011, Beyotime Biotechnology) para detectar la concentración de proteínas no unidas. La capacidad de carga del RBD-HR se calculó mediante la siguiente ecuación:

Se sacrificaron ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas por dislocación cervical. Las células epiteliales nasales de ratón (NEC) se aislaron de la mucosa del diafragma como se describe en la información complementaria36. Se adquirió una línea celular NEC de ratón (CAT: BFN6021547) de BLUEFBIO. Las BMDC se aislaron y cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía 10 % de FBS (Gibco, EE. UU.), 1 % de penicilina‒estreptomicina (Gibco, EE. mL de GM-CSF y 15 ng/mL de IL-457. Primero, marcamos el antígeno RBD-HR con 488 colorantes fluorescentes según las instrucciones del kit de etiquetado de proteínas (Invitrogen). Para los estudios de captación de RBD-HR por NEC o BMDC in vitro, se preincubó RBD-HR (1 μg/mL) marcado con fluorescencia con CCD (10 μg/mL) o PBS durante 30 min a 25 °C con agitación. A continuación, se coincubaron RBD-HR, CCD o CCD/RBD-HR con BMDC o NEC durante 30 min a 37 °C en una incubadora. Las células se recogieron sin tratamiento con EDTA y se lavaron tres veces con PBS helado. Se usaron microscopía confocal y FCM para determinar la captación de antígeno.

Se obtuvieron células T en bazo de ratón BALB/c hembra de 6 a 8 semanas sin tratar mediante un kit de enriquecimiento de células T CD3 de ratón (Stemcell). Luego, las células T se marcaron con fluorescencia usando un kit de marcaje de células CFSE (Abcam) para detectar la proliferación de células T. Los BMDC, los NEC primarios (obtenidos de aproximadamente 20 ratones) o las líneas celulares NEC se trataron con CCD/RBD-HR (10 o 20/1 μg/mL) durante 24 h a 37 °C. Estos BMDC o NEC tratados y no tratados (2 × 105 células/mL) luego se coincubaron con células T marcadas con CFSE (1 × 106 células/mL) en una incubadora a 37 °C durante 48 h. A continuación, FCM detectó las células T en proliferación, las células T activadas y las células T experimentadas con antígeno. En el experimento de cocultivo de NEC y células T, se investigó el efecto de MHC II expresado en NEC en células T CD4+ con un anticuerpo IA/IE anti-ratón neutralizante (BioLegend, 2,5 μg/ml). Rat IgG2b, κ (BioLegend) se utilizó como control de isotipo.

Se mezclaron 10 μg de proteína RBD-HR recombinante purificada con 100 μg de CCD y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Luego, se agregó PBS a un volumen final de 50 μL. Se inmunizaron por vía intranasal ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas (n = 5 por grupo) con 50 μL de PBS, RBD-HR o vacuna de proteína recombinante (CCD/RBD-HR) los días 0, 14 y 28. Postinmunización Se recolectaron sueros y líquido BAL los días 35 y 260 después de la primera inmunización y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. Conejos hembra (6 meses, n = 3 por grupo) se inmunizaron por vía intranasal con 200 μL de vacunas. Los conejos del grupo RBD-HR se inocularon con 20 μg de RBD-HR y los del grupo CCD/RBD-HR se inmunizaron con un complejo de 20 μg de proteína RBD-HR formulada con 200 μg de adyuvantes CCD. Se recogieron muestras de sangre de la vena marginal de la oreja el día 35 después de la primera inmunización.

Los anticuerpos específicos de antígeno se analizaron como se describió previamente12. Brevemente, las placas ELISA de 96 pocillos (Thermo Scientific, EE. UU.) se recubrieron con 1 μg/mL de antígenos RBD-HR durante la noche a 4 °C, se lavaron con PBST (PBS con 0,05 % de Tween-20) tres veces y se bloquearon con 0,5 % de Tween-20. Solución de BSA durante 1 h a 37 ° C. Después de lavar las placas con PBST una vez, se añadieron diluciones de suero o fluido BAL a las placas y se incubaron a 37 °C durante 2 h. Después de lavarse tres veces con PBST, las placas se añadieron a 100 μL de anticuerpo conjugado con HRP (anti-ratón de cabra-IgG (1:10 000), IgG1 (1:10 000), IgG2a (1:10 000), IgG2c (1: 10000), IgG3 (1:10000), IgA (1:5000) y cabra anti-conejo-IgG (1:5000)) y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Después de tres lavados con PBST con agitación, se agregaron 100 μL de TMB a cada pocillo de las placas ELISA. Después de una reacción de 10 min, se agregaron 100 μL de solución de parada a cada pocillo para detener la reacción. El valor de absorbancia se leyó a 450 nm en un SpectraMax ABS (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.).

Las placas de filtración ELISpot de 96 pocillos estériles (Sigma, EE. UU.) se recubrieron con 3 μg/mL de proteína SARS-CoV-2 RBD durante la noche a 4 °C, se lavaron con PBS cinco veces y se bloquearon con medio de cultivo para linfocitos durante 2 h a 37 °C. Luego, los linfocitos de sangre, bazo y médula ósea se aislaron con medio de separación de linfocitos de ratón (Dakewe Biotech Co., Ltd., China), se resuspendieron con medio de cultivo y se agregaron a las placas después de al menos un lavado. Después de la incubación a 37 °C y CO2 humidificado al 5% durante la noche, las placas se lavaron con PBS cinco veces y se incubaron con anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (1:10000) (Invitrogen, EE. UU.) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de cinco lavados adicionales, se añadió solución de sustrato TMB ELISpot (Mabtech, Suecia) para la formación de manchas. La reacción se terminó con agua de enjuague. Los puntos se capturaron y contaron con el lector IRIS FluoroSpot/ELISpot (Mabtech).

En el experimento que bloquea la unión de RBD a ACE2, usamos tres proteínas RBD-Fc, RBD-WT, RBD-Delta y RBD-Omicron. Los sueros de 35 días de cada grupo se añadieron a 0,3 μg/mL de proteína RBD-Fc en BPBS (BSA al 0,1 % en PBS) a una dilución 1:270 y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente se añadió RBD-Fc con o sin suero a células HEK293T que expresan ACE2 (293T/ACE2, construidas por nuestro grupo58, 5 × 105/mL) y se incubaron durante 30 min a 4 °C. Después de lavar las células tres veces con PBS enfriado con hielo, se añadieron anticuerpos IgG Fc antihumanos conjugados con PE (BioLegend, EE. UU.) a 1:100 y se tiñeron durante 30 min a 4 °C. Las células se recogieron y se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo. La unión de RBD a ACE2 se detectó con FCM.

Los ensayos de neutralización de SARS-CoV-2 en vivo fueron descritos por Yang et al.58,59. Brevemente, se sembraron células Vero E6 (Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, 5 × 104/pocillo) en placas de fondo plano de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h en DMEM completo. Las muestras de suero se inactivaron mediante incubación a 56 °C durante 30 min y se realizaron diluciones en serie triples con DMEM completo. Luego, 50 μL de muestras de suero diluidas se coincubaron con 50 μL de virus SARS-CoV-2 vivo a 100 TCID50 (50% de dosis infecciosa de cultivo de tejidos) en una incubadora a 37 °C durante 1 h. La mezcla de virus y suero se añadió a las células Vero y se incubó durante 72 ha 37 °C. Se usó un microscopio para registrar el efecto citopático (CPE), y se calcularon los títulos de neutralización de los sueros inmunizados que dieron como resultado la inhibición de EC50 (50% de neutralización).

En resumen, volúmenes iguales de diferentes pseudovirus que expresan luciferasa o EGFP (WT, B1.617.2 (Delta), BA.1 (Omicron), BA.2, BA.2.12.1, BA.3, BA.4/ 5) se mezclaron con soluciones de suero diluidas en serie y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Las células 293T/ACE2 se recolectaron y sembraron a una densidad de 1,5 × 105/ml en placas de 96 pocillos. Luego, se añadió una mezcla de pseudovirus y suero a las células 293 T/ACE2. Después de que las células se cultivaron en la incubadora durante 48 h, se detectó la expresión de eGFP en las células infectadas mediante microscopía de fluorescencia y FCM. Luego, se eliminó el sobrenadante celular, se agregaron a cada pozo 50 μL de PBS y 50 μL de reactivo de lisis con sustrato de luciferasa, y se leyeron las unidades relativas de luz de las placas utilizando un lector de microplacas multimodo (PerkinElmer).

Para los ensayos de unión a proteínas RBD-HR, se preincubó CCD (30 μg/mL) con Neu5Ac (Selleck; Cat: 131-48-6; 120 μg/mL) durante 10 min a temperatura ambiente. El RBD-HR marcado con His (10 μg/mL) se preincubó con CCD (30 μg/mL) o una mezcla de CCD y Neu5Ac (CCD/Neu5Ac) durante 20 min en una incubadora a 37 °C. Ambos tipos de NEC, incluidas las líneas celulares y los NEC primarios adquiridos de ratones BALB/c no tratados, se utilizaron en el experimento. Algunos NEC que no habían sido pretratados se incubaron con la mezcla (CCD/RBD-HR o CCD/RBD-HR/Neu5Ac) durante 30 min a temperatura ambiente. Como alternativa, algunos NEC se trataron primero con NA (Sigma, N2876, 0,5 U/mL) durante la noche y luego se incubaron con una mezcla de CCD/RBD-HR. Después de tres lavados, las células se tiñeron con anticuerpo anti-His conjugado con APC, y FCM detectó el RBD-HR unido a la superficie en NEC.

La unión a la superficie celular de RBD-HR podría detectarse mediante inmunofluorescencia. Después de que la línea celular NEC se incubó con la mezcla (CCD/RBD o CCD/RBD-HR/Neu5Ac) o la línea celular NEC tratada con NA se incubó con CCD/RBD-HR, todas las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con anticuerpo primario anti-S humano (1:200; Sino Biological; Cat: 40150-001) y anticuerpo secundario anti-humano 488 (1:200; Proteintech; Cat: SA00003-12). Las células de la sección se observaron con un microscopio de fluorescencia (Leica, Alemania).

Algunos ratones BALB/c fueron inoculados con CCD/RBD-HR (100/10 μg) o CCD/RBD-HR/Neu5Ac (100/10/300 μg) por vía intranasal. Algunos ratones BALB/c se trataron por vía intranasal con 10 μL de NA (5 U/mL) durante 6 veces consecutivas con una hora de anticipación para eliminar los ácidos siálicos en la superficie de NEC in vivo antes de la inoculación con CCD/RBD-HR ( 100/10 μg) por vía intranasal. Se usaron tejidos nasales de ratón adquiridos después de 24 h para detectar la unión de RBD-HR en la cavidad nasal in vivo. Los anticuerpos en el suero y BAL obtenidos el día 14 después de la inmunización se determinaron por ELISA.

Se inmunizaron por vía intranasal ratones BALB/c hembra (6 a 8 semanas, n = 5 por grupo) con (1) PBS, (2) 100 μg de CCD o (3) 10 μg de RBD-HR con 100 μg de CCD en un recipiente de 50 μL. volumen en los días 0, 14 y 28 y desafiado con 5 × 105 TCID50 de SARS-CoV-2 Omicron variantes por vía intranasal. En el día 4 después del desafío, se sacrificó a los ratones y se recogieron los tejidos. Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT‒qPCR) para detectar el ARN genómico viral (ARNg) cargado en los tejidos pulmonares, las tráqueas y los cornetes nasales. Los cebadores y conjuntos de sondas específicos fueron los siguientes: directo, 5'-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3'; inversa, 5′-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3′; sonda, 5′-FAM-ACGCCGCATTACGTTTGGTGGACCBHQ1-3′. Se recogieron tejidos pulmonares de los ratones expuestos y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% durante al menos 72 h. Luego, los tejidos se incluyeron en cera de parafina y se cortaron en secciones de 5 μm para la tinción estándar con hematoxilina y eosinita (H&E).

Los sobrenadantes cultivados de DC y NEC se recogieron después de estimular las células durante 24 h. Los sobrenadantes de células T con DC se recogieron después de cocultivar durante 48 h a 37 ° C antes de un tratamiento de 4 h con brefeldin A (BFA, BioLegend). Las citocinas en los sobrenadantes, incluidas IL-4, IFN-γ, IL-6 y otras, se determinaron mediante ELISA (Invitrogen, EE. UU.) y la prueba de ensayo Magnetic Luminex. Se vacunaron ratones BALB/c por vía intranasal con CCD/RBD-HR (100/10 μg por ratón) los días 0, 14 y 28. Se obtuvo sangre el día 7 después de la tercera vacunación y se realizó bioquímica sanguínea o recuento de células sanguíneas. por Haiqi Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China).

El RBD marcado con fluorescencia se produjo mediante biotinilación y tetramerización como se informó anteriormente para identificar las células B que se unen a RBD6,60. Brevemente, se añadió PE conjugada con estreptavidina (BioLegend) a la proteína RBD Spike del SARS-CoV-2 biotinilada (AcroBiosystems) en una proporción molar de 6:1 y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente para la tetramerización. El tetrámero de RBD resultante se usó para la tinción de células B específicas de RBD y la detección de FCM.

Los estudios de FCM se llevaron a cabo utilizando un citómetro de flujo NovoCyte con NovoExpress 1.4.1 (ACEA Biosciences, Inc.).

Para los estudios de captación de RBD-HR por NEC in vivo, de 6 a 8 semanas, se vacunaron ratones hembra BALB/c por vía intranasal con 100 μg de CCD más 10 μg de RBD-HR marcado con fluorescencia. Después de ~24 h, los tejidos epiteliales nasales de los ratones inmunizados se adquirieron y se prepararon en una suspensión unicelular.

Para detectar el efecto de CCD en la activación de DC y NEC in vitro, se sembraron BMDC o NEC en placas de 12 pocillos (5 × 105/pocillo). Después de ~2 h, las células se incubaron con PBS, RBD-HR o CCD/RBD-HR durante 24 h en medio RPMI 1640. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS helado y se tiñeron con anticuerpos.

Para el reclutamiento de células del ganglio linfático cervical (CLN) que drena el epitelio nasal, se vacunaron ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas con la vacuna (100 μg CCD/10 μg RBD-HR) a través de gotas intranasales. 72 h después de la inoculación, se sacrificó a los ratones y se recogieron los CLN para su detección. Los ganglios linfoides se trituraron, se trataron con lisado de eritrocitos durante 1 minuto y se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo para obtener una suspensión unicelular. La forma en que se bloquean las celdas se ha descrito en informes anteriores32. Las diferentes poblaciones celulares se muestran en la Fig. 12a-e complementaria, incluidos los macrófagos (F4/80high), monocitos (Ly6Chigh), neutrófilos (Ly6Ghigh) y eosinófilos (F4/80int y dispersión lateral). Tres tipos de DC, incluidos CD11blow DC, CD11b + DC y mDC, se activaron en la Fig. 12f complementaria. Para las poblaciones de células Tfh y GCB específicas de RBD, se vacunaron ratones BALB/c por vía intranasal con 100 μg de CCD más 10 μg de RBD-HR los días 0, 14 y 28. Cuatro semanas después de la última inmunización, se obtuvo y detectó CLN. La estrategia de activación para GCB y Tfh se mostró en la figura complementaria 6a, b60.

Para el ensayo celular en BAL, se sacrificaron ratones BALB/c vacunados el día 28 después de la tercera inmunización. El BAL se obtuvo inyectando dos veces 0,5 ml de hielo PBS. Las células de BAL se recolectaron mediante centrifugación (320 × g, 3 min), se resuspendieron con medio RPMI 1640, se sembraron en placas de 12 pocillos y se reestimularon con grupos de péptidos para RBD durante 16 h, incluido el tratamiento de 4 h con BFA para el análisis de T respuestas celulares. Los péptidos OVA257–264 y OVA323–339 se utilizaron como control de antígeno irrelevante. El día 7 después del último refuerzo, se recogieron células en BAL para detectar respuestas de AM. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo.

Para la detección de DC CD103+ y células T en los pulmones, se sacrificaron ratones BALB/c o C57BL/6 vacunados por vía intranasal (6–8 semanas, hembras) los días 7 y 28 después de la tercera inmunización, respectivamente. Los tejidos pulmonares se trituraron primero en trozos extremadamente pequeños y se digirieron en DMEM que contenía colagenasa tipo 1 (0,5 %) y colagenasa tipo IV (0,5 %) en una incubadora a 37 °C durante una hora. Los tejidos pulmonares digeridos se filtraron con filtros de células de malla 70, se trataron con tampón de lisis de glóbulos rojos y se lavaron tres veces para obtener suspensiones de células individuales para la detección de FCM. Algunas células individuales de tejidos pulmonares se reestimularon con grupos de péptidos RBD o antígenos irrelevantes durante 16 h como se mencionó anteriormente para el análisis de FCM.

Cuatro semanas después de la tercera vacunación, se recogió la médula ósea, se lisó, se lavó dos veces y se tiñó con anticuerpos para determinar las células plasmáticas productoras de IgG específicas de RBD y los MBC.

Para la detección de la unión de RBD-HR a NEC in vivo, se inmunizaron intranasalmente ratones hembra BALB/c con CCD/RBD-HR (100 μg/10 μg por ratón) con o sin pretratamiento con NA durante 6 a 8 semanas. Se adquirieron cornetes nasales, se descalcificaron durante 3 meses, se incluyeron en parafina y se seccionaron verticalmente con 3 mm de espesor. Las secciones se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 5 a 10 min a temperatura ambiente y se bloquearon con suero de cabra al 10 % durante media hora. Sin lavar, las secciones se tiñeron con el primer anticuerpo (SARS-CoV-2 Spike Antibody, Rabbit PAb, 1:1000, Cat: 40589-T62, Sino Biological) durante la noche a 4 °C y el segundo anticuerpo (Goat-anti rabbit IgG, Alexa Fluor, 1:1000, Cat: A11008, Invitrogen) durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones se observaron con un microscopio confocal Olympus IX73 con el software estándar CellSens 2.1 (Olympus Corporation).

Se inmunizaron por vía intranasal ratones BALB/c hembra (6–8 semanas) los días 0, 14 y 28 y se sacrificaron el día 35. Se obtuvieron órganos vitales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) y piezas nasales y se fijaron en 4%. formalina tamponada durante 72 h, embebida en parafina y cortada en rodajas de 3 μm de espesor. Los cortes se desparafinaron en etanol y xileno y luego se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E). Los portaobjetos de patología se digitalizaron utilizando Pannoramic MIDI (3DHISTECH).

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 8.0. Los datos de FCM se analizaron con el software FlowJo V.10 y NovoExpress 1.4.1. Los valores de P se calcularon con ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett y ANOVA bidireccional seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Sidak o las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos se expresan como la media (geométrica) ± SEM (media y error estándar de la media). Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos y ns se refiere a no significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles con el documento y su información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Lam, JH et al. Formulación de pico beta intranasal basada en polímeros de membrana celular artificial como vacuna Covid-19 de segunda generación. ACS Nano 16, 16757–16775 (2022).

Xia, S., Wang, L., Zhu, Y., Lu, L. y Jiang, S. Origen, características virológicas, evasión inmune e intervención de los sublinajes SARS-CoV-2 Omicron. Transducto de señal. Objetivo Ther. 7, 241 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aschwanden, C. Cinco razones por las que la inmunidad colectiva de COVID es probablemente imposible. Naturaleza 591, 520–522 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhou, Y., Zhi, H. & Teng, Y. El brote de linajes Omicron SARS-CoV-2, escape inmunológico y efectividad de la vacuna. J.Med. Virol 95, e28138 (2022).

Él, C. et al. Una vacuna de proteína trimérica autoensamblada induce inmunidad protectora contra la variante Omicron. Nat. común 13, 5459 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afkhami, S. et al. La administración de la mucosa respiratoria de la vacuna COVID-19 de próxima generación brinda una protección sólida contra las cepas ancestrales y variantes del SARS-CoV-2. Celda 185, 896–915.e819 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, Y. et al. Proteínas de espiga con parches de mutación y mosaico de linaje para la vacuna COVID-19 de amplio espectro. Microbio huésped celular 30, 1732–1744 (2022).

Alu, A. et al. Vacunas intranasales COVID-19: del banco a la cama. EBioMedicine 76, 103841 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Russell, MW & Mestecky, J. Inmunidad de la mucosa: el eslabón perdido para comprender la infección y transmisión por SARS-CoV-2. Frente. inmunol. 13, 957107 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vacunas COVID-19 de la OMS. https://www.who.int/.

Caballero, FC et al. La inmunización de la mucosa con una vacuna de nanopartículas sensible al pH induce células T de memoria protectoras CD8 (+) residentes en los pulmones. ACS Nano 13, 10939–10960 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lei, H. et al. La administración intranasal de una vacuna RBD recombinante induce inmunidad a largo plazo contra las variantes del SARS-CoV-2 incluidas en Omicron. Transducto de señal. Objetivo Ther. 7, 159 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pulendran, B., Arunachalam, PS & O'Hagan, DT Conceptos emergentes en la ciencia de los adyuvantes de vacunas. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 20, 454–475 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, S. et al. Puntos de carbono fluorescentes modificados con polietilenimina como sistema de administración de vacunas para la inmunización intranasal. ACS Biomater. ciencia Ing. 4, 142–150 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, S. et al. El desarrollo de puntos de carbono: desde la perspectiva de la química de materiales. Mate. Hoy 51, 188–207 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Pierrat, P. et al. Administración pulmonar eficiente in vitro e in vivo de ácido nucleico mediante nanoportadores basados ​​en puntos de carbono. Biomateriales 51, 290–302 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Feng, T., Ai, X., An, G., Yang, P. y Zhao, Y. Puntos de carbono convertibles en carga para la administración de fármacos guiada por imágenes con una mayor eficiencia terapéutica del cáncer in vivo. ACS Nano 10, 4410–4420 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Xiao, YP et al. Polimerización por apertura de anillo de diepóxidos como método alternativo para superar el dilema de PEG en la administración de genes. Polímero 134, 53–62 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Wang, HJ y col. Puntos de carbono a base de ácido hialurónico para la entrega eficiente de genes y la obtención de imágenes celulares. RSC Avanzado. 7, 15613–15624 (2017).

Artículo ADS CAS Google Académico

Blanco, E., Shen, H. & Ferrari, M. Principios del diseño de nanopartículas para superar las barreras biológicas a la administración de fármacos. Nat. Biotecnología. 33, 941–951 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Focosi, D., McConnell, S. & Casadevall, A. La variante de preocupación de Omicron: diversificación y evolución convergente en la proteína espiga y escape de los anticuerpos monoclonales anti-Spike. Resistencia a las drogas. Actualizar 65, 100882 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, K. et al. Prototipo protector-Vacunas quiméricas RBD-dímeras Beta y Delta-Omicron frente al SARS-CoV-2. Celda 185, 2265–2278.e2214 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Levin, EG et al. Disminución de la respuesta humoral inmune a la vacuna BNT162b2 Covid-19 durante 6 meses. N. ingl. J.Med. 385, e84 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Slifka, MK & Amanna, I. Cómo los avances en inmunología brindan información sobre cómo mejorar la eficacia de las vacunas. Vacuna 32, 2948–2957 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K. & Ahmed, R. De las vacunas a la memoria y viceversa. Inmunidad 33, 451–463 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Laidlaw, BJ & Ellebedy, AH La respuesta de las células B del centro germinal al SARS-CoV-2. Nat. Rev. Inmunol. 22, 7–18 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mudd, PA y col. La vacunación con ARNm de SARS-CoV-2 provoca una respuesta robusta y persistente de células auxiliares foliculares T en humanos. Celda 185, 603–613.e615 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Szabo, PA, Miron, M. & Farber, DL Ubicación, ubicación, ubicación: células T de memoria residentes en tejidos en ratones y humanos. ciencia inmunol. 4, eaas9673 (2019).

Carbone, FR Propiedades únicas de las células T de memoria residentes en tejidos en los pulmones: implicaciones para COVID-19 y otras enfermedades respiratorias. Nat. Rev. Inmunol. 1–7 (2022).

Rakhra, K. et al. Explotación de la albúmina como chaperona de la vacuna de la mucosa para la generación robusta de células T de memoria residentes en los pulmones. ciencia inmunol. 6, eabd8003 (2021).

Grant, RA et al. Circuitos entre macrófagos infectados y células T en la neumonía por SARS-CoV-2. Naturaleza 590, 635–641 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, WC et al. Un adyuvante de la vacuna contra la malaria basado en la unión de antígenos recombinantes a los liposomas. Nat. Nanotecnología. 13, 1174–1181 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coffman, RL, Sher, A. & Seder, RA Adyuvantes de vacunas: poner en funcionamiento la inmunidad innata. Inmunidad 33, 492–503 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carroll, EC et al. El quitosano adyuvante de la vacuna promueve la inmunidad celular a través de la inducción dependiente de cGAS-STING del sensor de ADN de interferones de tipo I. Inmunidad 44, 597–608 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo, M. et al. Mejora simultánea de la inmunidad celular y humoral mediante la formulación con alto contenido de sal del adyuvante Al(OH)(3). Resolución celular 27, 586–589 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arebro, J. et al. Las células epiteliales presentadoras de antígenos pueden desempeñar un papel fundamental en la alergia de las vías respiratorias. J. Allergy Clin. inmunol. 137, 957–960.e957 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shenoy, AT et al. La presentación de antígenos por parte de las células epiteliales pulmonares dirige la función de las células CD4(+) T(RM) y regula la inmunidad de barrera. Nat. común 12, 5834 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bajo, JS et al. La reactivación de células T de memoria residentes en tejidos por diversas células presentadoras de antígeno imparte distintas respuestas funcionales. Exp. J. Medicina. 217, e20192291 (2020).

Park, YJ et al. Estructuras de la glicoproteína espiga MERS-CoV en complejo con receptores de unión de sialósido. Nat. Estructura. mol. Biol. 26, 1151-1157 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramos-Martínez, IE et al. Sulfato de heparán y ácido siálico en unión viral: ¿dos caras de la misma moneda? En t. J. Mol. ciencia 23, 9842 (2022).

Hong, W. et al. Las histonas liberadas por NETosis mejoran la infectividad del SARS-CoV-2 al unir la subunidad 2 de la proteína espiga y el ácido siálico en las células huésped. Celúla. mol. inmunol. 19, 577–587 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mimura, N. & Asano, A. Efecto sinérgico de la colchicina y la citocalasina D sobre la fagocitosis por macrófagos peritoneales. Naturaleza 261, 319–321 (1976).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Waltz, E. China e India aprueban las vacunas nasales contra el COVID. ¿Son un cambio de juego? https://www.nature.com/articles/d41586-022-02851-0 (2022).

Waltz, E. Cómo las vacunas en aerosol nasal podrían cambiar la pandemia. https://www.nature.com/articles/d41586-022-02824-3 (2022).

Kaneko, N. et al. Pérdida de células auxiliares foliculares T que expresan Bcl-6 y centros germinales en COVID-19. Celda 183, 143–157.e113 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodda, LB et al. La memoria inmunitaria funcional específica del SARS-CoV-2 persiste después de una COVID-19 leve. Celda 184, 169–183.e117 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, Z. et al. Memoria inmune humoral y celular a cuatro vacunas COVID-19. Celda 185, 2434–2451.e2417 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sokal, A. et al. La vacunación con ARNm de individuos ingenuos y recuperados de COVID-19 provoca potentes células B de memoria que reconocen variantes del SARS-CoV-2. Inmunidad 54, 2893–2907.e2895 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schenkel, JM & Masopust, D. Células T de memoria residentes en tejidos. Inmunidad 41, 886–897 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grau-Expósito, J. et al. Respuestas de células T de memoria residentes periféricas y pulmonares contra el SARS-CoV-2. Nat. común 12, 3010 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lapuente, D. et al. Inmunidad protectora de la mucosa contra el SARS-CoV-2 después de la inmunización heteróloga de refuerzo de la mucosa sistémica heteróloga. Nat. común 12, 6871 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hassan, AO et al. Una vacuna ChAd intranasal de dosis única protege las vías respiratorias superiores e inferiores contra el SARS-CoV-2. Celda 183, 169–184.e113 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lei, H. et al. Nanotransportadores catiónicos como potentes adyuvantes para la vacuna recombinante S-RBD del SARS-CoV-2. Transducto de señal. Objetivo. El r. 5, 291 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manh, TP, Alexandre, Y., Baranek, T., Crozat, K. & Dalod, M. Las células dendríticas derivadas de monocitos, convencionales y plasmacitoides experimentan una reprogramación genética profunda y convergente durante su maduración. EUR. J. Immunol. 43, 1706–1715 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Edelson, BT et al. Las células dendríticas CD103+ periféricas forman un subconjunto unificado relacionado con el desarrollo de las células dendríticas convencionales CD8alfa+. Exp. J. Medicina. 207, 823–836 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Él, X. et al. Puntos de carbono derivados de polímeros catiónicos para mejorar la administración de genes y la obtención de imágenes celulares. Biomateria. ciencia 7, 1940-1948 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Inaba, K. et al. Generación de un gran número de células dendríticas a partir de cultivos de médula ósea de ratón complementados con factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos. Exp. J. Medicina. 176, 1693-1702 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, J. et al. Una vacuna dirigida al RBD de la proteína S del SARS-CoV-2 induce inmunidad protectora. Naturaleza 586, 572–577 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Huynh, A. et al. Características de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en sujetos recuperados de COVID-19. Virus 13, 697 (2021).

Alameh, MG et al. Las nanopartículas de lípidos mejoran la eficacia de las vacunas de subunidades de proteína y ARNm al inducir respuestas humorales y de células T auxiliares foliculares sólidas. Inmunidad 54, 2877–2892.e2877 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias para Jóvenes Académicos Excelentes (32122052), la Innovación y el Desarrollo Regional de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (No. U19A2003) y el Proyecto de Cooperación Internacional de la Provincia de Sichuan (2021YFH0002).

Estos autores contribuyeron por igual: Hong Lei, Aqu Alu, Jingyun Yang, Xi He.

Laboratorio de Investigación sobre el Envejecimiento y Objetivo de Medicamentos contra el Cáncer, Laboratorio Estatal Clave de Bioterapia y Centro del Cáncer, Centro Nacional de Investigación Clínica para Geriatría, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, 610041, Chengdu, China

Hong Lei, Aqu Alu, Jingyun Yang, Xi He, Cai He, Wenyan Ren, Zimin Chen, Weiqi Hong, Li Chen, Xuemei He, Li Yang, Jiong Li, Zhenling Wang, Wei Wang, Yuquan Wei, Guangwen Lu, Xiangrong Song y Xiaowei Wei

WestVac Biopharma Co. Ltd., Chengdu, China

Li Yang, Jiong Li, Zhenling Wang, Wei Wang, Yuquan Wei, Guangwen Lu, Xiangrong Song y Xiawei Wei

Centro Nacional de Investigación de Primates de Bioseguridad de Alto Nivel de Kunming, Instituto de Biología Médica, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Yunnan, China

Shuiyao Lu

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

XW, XS, GL y SL concibieron y supervisaron la investigación, además de diseñar los experimentos. HL preparó la vacuna, los animales vacunados, determinó los títulos y funciones de los anticuerpos y analizó los datos. Xi H. preparó un adyuvante CCD y determinó sus interacciones con la proteína RBD-HR. JY realizó la infección auténtica por SARS-CoV-2 in vitro y los experimentos de desafío en ratones con la variante Omicron. ZC formó clonación y expresión de genes, proteína RBD-HR expresada y purificada. HH, CH, WR, WH, LC y Xuemei H. ayudaron con los experimentos de FCM. HL y AA hicieron el resto de los experimentos y escribieron el manuscrito. LY, JL, ZW, WW, YW y HH analizaron e interpretaron los resultados y ayudaron con el ajuste de las direcciones. YW y XW revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia con Shuiyao Lu, Guangwen Lu, Xiangrong Song o Xiawei Wei.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Lei, H., Alu, A., Yang, J. et al. La vacuna intranasal con adyuvante de puntos de carbono reticulados catiónicos induce inmunidad protectora contra las variantes del SARS-CoV-2 incluidas en Omicron. Nat Comun 14, 2678 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38066-8

Descargar cita

Recibido: 03 enero 2023

Aceptado: 14 abril 2023

Publicado: 09 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38066-8

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.